เทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเซลล์สำหรับการอนุรักษ์สัตว์ป่า


สัตว์ป่าสงวนของไทย ตามพระราชบัญญัติสงวนและคุ้มครองสัตว์ป่า พ.ศ. 2562 มีทั้งสิ้น 19 ชนิด คือ นกเจ้าฟ้าหญิงสิรินธร แรด กระซู่ กูปรีหรือโคไพร ควายป่า ละองหรือละมั่ง สมัน เลียงผา กวางผา นกแต้วแล้วท้องดำ นกกระเรียน แมวลายหินอ่อน สมเสร็จ เก้งหม้อ พะยูน วาฬบรูด้า วาฬโอมูระ เต่ามะเฟืองและปลาฉลามวาฬ

สัตว์ป่าบางชนิดใกล้สูญพันธุ์ และบางชนิดก็สูญพันธุ์ไปแล้ว เช่น สมัน บางชนิดเริ่มมีจำนวนน้อยลง เช่น พะยูน การช่วยกันอนุรักษ์สัตว์ป่าถือเป็นวิธีที่ดีที่สุดที่จะช่วยให้ความเสี่ยงต่อการสูญพันธุ์ในธรรมชาติของสัตว์ป่าลดลง แต่ยังมีปัจจัยหลาย ๆ อย่างที่ไม่สามารถควบคุมได้ทั้งปัญหาบุกรุกที่อยู่อาศัยของสัตว์ป่า แหล่งอาหารของสัตว์ป่าถูกทำลาย การถูกล่าเพื่อนำมาเป็นอาหาร สภาพแวดล้อมและสภาพภูมิอากาศที่เปลี่ยนแปลงไป เป็นต้น

จากการศึกษาข้อมูลพบว่าหลาย ๆ หน่วยงานเห็นความสำคัญและพยายามเพิ่มจำนวนสัตว์ที่ใกล้สูญพันธุ์ ซึ่งสามารถทำได้หลายวิธี ทั้งการจัดการผสมพันธุ์แบบธรรมชาติ การผสมเทียม การย้ายฝากตัวอ่อน การปฏิสนธิในหลอดแก้ว เป็นต้น จากรายงานของ ดร.รังสรรค์ พาลพ่าย พบว่า การโคลนนิ่ง เป็นอีกวิธีที่น่าสนใจและมีการศึกษาทดลองกับสัตว์บางชนิดเพื่อนำมาใช้ในการเพิ่มจำนวนสัตว์ใกล้สูญพันธุ์ต่อไป


โคลนนิ่ง (Cloning) คืออะไร

การโคลนนิ่งเป็นกระบวนการสร้างสิ่งมีชีวิตให้มีลักษณะทางกายภาพและพันธุกรรมเหมือนกัน โดยนำนิวเคลียสจากเซลล์ร่างกาย (somatic cell) ของสัตว์ที่ต้องการโคลนนิ่งมาใช้เป็นเซลล์ต้นแบบ (donor cell) ฉีดเข้าไปในไข่ที่กำจัดนิวเคลียสออกแล้ว ทำให้ได้ลูกที่มีเพศ พันธุกรรมและรูปร่างเหมือนกันกับสัตว์ตัวต้นแบบอย่างมาก ต่างจากการสืบพันธุ์ตามธรรมชาติที่ต้องใช้เซลล์สืบพันธุ์เพศผู้และเซลล์สืบพันธุ์เพศเมียมาผสมกัน โดยผู้บุกเบิกการใช้เซลล์ร่างกายมาเป็นเซลล์ต้นแบบในการโคลนนิ่งที่ประสบความสำเร็จเป็นครั้งแรกของโลก คือ ดร.เอียน วิลมุต (Ian Wilmut) และคณะ เมื่อปี พ.ศ. 2540 จากการโคลนนิ่งลูกแกะ “ดอลลี่” ซึ่งใช้เซลล์เต้านมของแกะโตเต็มวัยอายุ 6 ปี มาเป็นเซลล์ต้นแบบ และต่อมานักวิทยาศาสตร์ทั่วโลกได้ทำการศึกษาทดลองนำเซลล์จากส่วนต่าง ๆ ของร่างกายสัตว์อีกหลายชนิดมาทำเป็นเซลล์ต้นแบบ จนได้ลูกสัตว์เกิดมาอีกหลายชนิด เช่น โค กระบือ สุกร แมว ล่อ ม้า กระทิง หนูขาว หนูถีบจักร กระต่าย เฟอเรท เป็นต้น


การโคลนนิ่งในประเทศไทย

ในประเทศไทยมีการนำการโคลนนิ่งมาใช้และประสบความสำเร็จอยู่ไม่น้อย เช่น การโคลนนิ่งของ ดร.รังสรรค์ พาลพ่ายและคณะ ที่ได้ลูกโคตัวแรกของประเทศไทยและเอเชียอาคเนย์ รายที่ 3 ของเอเชียและรายที่ 6 ของโลก ชื่อ “อิง” เป็นลูกโคสีดำ เกิดเมื่อวันที่ 6 มีนาคม พ.ศ. 2543 จากการนำเซลล์ใบหูของโคแบรงกัสเพศเมียมาเป็นเซลล์ต้นแบบ ต่อมาได้ประสบความสำเร็จในการทำการโคลนนิ่งโคอีกมายมายนับสิบตัวจากการใช้เนื้อเยื่อจากใบหูโคมาเป็นเซลล์ต้นแบบ รวมทั้ง “ขาวมงคล” ลูกโคโคลนนิ่งพันธุ์ขาวลำพูนเพศผู้ ตัวแรกของประเทศไทยเมื่อวันที่ 21 มีนาคม พ.ศ. 2550 และ “เศวต” เมื่อวันที่ 1 กุมภาพันธ์ พ.ศ. 2555 

จากข้างต้นเป็นตัวอย่างการโคลนนิ่งโดยใช้สัตว์ชนิดเดียวกัน (intraspecies cloning) เนื่องจากใช้ไซโทพลาซึม (cytoplasm) ของผู้รับและเซลล์ต้นแบบมาจากสัตว์ชนิดเดียวกันจึงมีจำนวนโครโมโซมเท่ากันและให้ผลการศึกษาที่ประสบความสำเร็จ แต่ปัจจุบันได้มีการศึกษาการโคลนนิ่งข้ามชนิด (interspecies cloning) เพื่อนำมาใช้ในการเพิ่มจำนวนสัตว์ใกล้สูญพันธุ์โดยใช้ไซโทพลาซึมผู้รับเป็นสัตว์ที่มีจำนวนมาก เช่น โคทั่ว ๆ ไป และใช้เซลล์ต้นแบบจากสัตว์ที่ใกล้สูญพันธุ์ ทั้งสองฝ่ายมาจากสัตว์ต่างชนิดและมีโครโมโซมไม่เท่ากัน เช่น การศึกษาของ ดร.รังสรรค์ พาลพ่ายและคณะ ที่ทำการโคลนนิ่งกระทิงโดยใช้เซลล์ไฟโบรบลาสต์ (fibroblast cell) ผิวหนังของกระทิงเพศผู้มาเป็นเซลล์ต้นแบบและใช้ไข่โคเป็นไซโทพลาซึมผู้รับ ได้ลูกกระทิงมา 1 ตัว แรกเกิดมีสุขภาพดีแต่เสียชีวิตใน 12 ชั่วโมงต่อมาเนื่องจากปอดมีการเจริญไม่สมบูรณ์ เป็นต้น ซึ่งผลการทดลองครั้งนี้ถือเป็นการเริ่มต้นที่น่าสนใจในการเตรียมพร้อมเพื่ออนาคตได้

กระบวนการโคลนนิ่งโดยใช้เซลล์ร่างกาย (somatic cell) ประกอบด้วย 7 ขั้นตอน คือ 

1) การเตรียมเซลล์ต้นแบบ
2) การเตรียมไซโทพลาซึมผู้รับ
3) การฉีดเซลล์ต้นแบบเข้าไปในไซโทพลาซึมผู้รับ
4) การเชื่อมเซลล์ต้นแบบให้ติดกับไซโทพลาซึมผู้รับ
5) การกระตุ้นให้เซลล์แบ่งตัว
6) การเลี้ยงตัวอ่อนโคลนนิ่งในหลอดแก้ว
7) การย้ายตัวอ่อนโคลนนิ่งสู่แม่ตัวรับ

ซึ่งในแต่ละขั้นตอนมีรายละเอียดที่ค่อนข้างซับซ้อนและใช้งบประมาณและเทคโนโลยีไม่น้อยเลยทีเดียว แต่ขั้นตอนเริ่มต้นที่เราสามารถเตรียมได้ในห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเซลล์เพื่อเตรียมการหากในอนาคตมีความพร้อมในเรื่องงบประมาณและเทคโนโลยีก็คือ การเตรียมเซลล์ต้นแบบ (donor cell preparation) 


การเตรียมเซลล์ต้นแบบ (donor cell preparation) 

การเตรียมเซลล์ต้นแบบถือเป็นขั้นตอนเริ่มแรกของการทำโคลนนิ่ง ในการเตรียมเซลล์สามารถนำมาจากเนื้อเยื่อส่วนต่าง ๆ ของร่างกายสัตว์ที่โตเต็มวัยหรือตัวลูกอ่อน อาจเตรียมได้จาก ผิวหนัง กล้ามเนื้อ ตับ ไต ไขกระดูก ซึ่งต้องเป็นเนื้อเยื่อที่ไม่เน่าเปื่อย จึงมักนำมาจากสัตว์ที่ยังมีชีวิตอยู่ โดยทั่วไปนิยมใช้ปลายใบหูของสัตว์ที่ต้องการเตรียมนั้น เนื่องจากเก็บได้ง่าย และไม่เกิดการอักเสบของบาดแผลหลังการเก็บ ในการเก็บควรเช็ดทำความสะอาดบริเวณปลายใบหูด้วยแอลกอฮอล์ก่อนตัดปลายใบหูใส่ลงในหลอดอาหารเลี้ยงเซลล์หรือหลอดน้ำเกลือ (normal saline solution) แช่ในถังน้ำแข็งที่ควบคุมอุณหภูมิประมาณ 4 – 8 องศาเซลเซียส แล้วนำส่งห้องปฏิบัติการภายใน 12 ชั่วโมง 

ในห้องปฏิบัติการจะปฏิบัติงานในตู้ปลอดเชื้อ (biosafety cabinet class II) และใช้อุปกรณ์ที่ผ่านการทำให้ปราศจากเชื้อแล้ว นำชิ้นเนื้อที่ได้มาล้างทำความสะอาดด้วยสารละลายบัพเฟอร์ (phosphate buffer saline pH 7.2) ที่มียาต้านเชื้อจุลชีพ (antibiotic) ที่ค่อนข้างเข้มข้นจำนวน 3 ครั้ง ก่อนนำมาตัดย่อยด้วยกรรไกรให้มีขนาดที่เล็กลงเท่า ๆ กัน นำไปปั่นย่อยให้มีขนาดเล็กลงอีกโดยใช้น้ำยาย่อยเซลล์ เพื่อย่อยให้กลายเป็นเซลล์เดี่ยว ๆ จากนั้นนำไปปั่นแยกเซลล์ออกมาเพื่อนำไปเพาะเลี้ยงในน้ำยาเลี้ยงเซลล์ ภาชนะเพาะเลี้ยงอาจเป็นเพลทเลี้ยงเซลล์ (cell culture plate) หรือขวดเพาะเลี้ยงเซลล์ (cell culture flask) เลี้ยงในตู้บ่มเลี้ยงเชื้อ (incubator) ที่มีอุณหภูมิใกล้เคียงหรือเทียบเท่าอุณหภูมิร่างกายของสัตว์ที่นำเนื้อเยื้อมาเพาะเลี้ยงและมีคาร์บอนไดออกไซด์ เช่น เนื้อเยื่อเสือเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส และมีคาร์บอนไดออกไซด์ร้อยละ 5 จากนั้นจึงตรวจดูการเจริญเติบโตของเซลล์และตรวจสอบเบื้องต้นว่ามีการติดเชื้อรา แบคทีเรียหรือไม่ ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ชนิดหัวกลับ (inverted microscope) ที่กำลังขยาย 100 – 200 เท่า หากไม่มีการติดเชื้อจะเลี้ยงต่อไป

ลักษณะทั่วไปของเซลล์ที่เจริญขึ้นมาใหม่ซึ่งเป็นเซลล์ที่มาจากกล้ามเนื้อหรือผิวหนังจะมีรูปร่างเป็น กระสวยเรียงติดกัน เรียกว่า เซลล์ไฟโบรบลาสต์ (fibroblast cell) เมื่อเซลล์เจริญเติบโตเพิ่มขึ้น จะแยกเซลล์ไปเลี้ยงในภาชนะใหม่เพื่อเพิ่มปริมาณของเซลล์ เมื่อเพิ่มปริมาณเซลล์ได้มากพอ (อย่างน้อย 10 ล้านเซลล์) จึงนำเซลล์แบ่งใส่หลอดแช่แข็ง (cryo vial) ที่มีน้ำยาสำหรับแช่แข็งเซลล์ (freezing medium หรือ cryopreservation medium) เพื่อนำไปเก็บแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวที่มีอุณหภูมิ -196 องศาเซลเซียส เนื่องจากสามารถเก็บรักษาเซลล์ได้ในระยะเวลาที่ยาวนาน เมื่อต้องการนำมาใช้ในการโคลนนิ่ง สามารถนำเซลล์ที่เก็บไว้มาใช้ได้โดยนำมาทำละลายอย่างรวดเร็ว และเพาะเลี้ยงในภาชนะเพาะเลี้ยงเซลล์ 1 – 2 วัน ก่อนใช้น้ำยาย่อยแยกเซลล์ออกให้เป็นเซลล์เดี่ยว ๆ เพื่อคัดเซลล์ที่มีรูปร่างกลมปกติไปใช้เป็นเซลล์ต้นแบบสำหรับการโคลนนิ่งต่อไป

งานเพาะเลี้ยงเซลล์ ศูนย์เฝ้าระวังและติดตามโรคจากสัตว์ป่า สัตว์ต่างถิ่นและสัตว์อพยพ มีการ เตรียมเซลล์สัตว์และเซลล์ของสัตว์ป่าไว้ในรูปแบบธนาคารเซลล์ (cell bank) เพื่อเก็บรักษาพันธุกรรม (conservation) ของสัตว์ชนิดนั้น ๆ ไว้ เช่น เซลล์เก้งหม้อ เซลล์เสือปลา เซลล์เสือ เซลล์แมวดาว

ภาพที่ 1 เซลล์เก้งหม้อภายใต้กล้องจุลทรรศน์ชนิดหัวกลับ a) ที่กำลังขยาย 40 เท่า b) ที่กำลังขยาย 100 เท่า

ภาพที่ 2 เซลล์เสือปลาภายใต้กล้องจุลทรรศน์ชนิดหัวกลับ a) ที่กำลังขยาย 40 เท่า b) ที่กำลังขยาย 100 เท่า

ภาพที่ 3 เซลล์เสือภายใต้กล้องจุลทรรศน์ชนิดหัวกลับ a) ที่กำลังขยาย 40 เท่า b) ที่กำลังขยาย 100 เท่า

ภาพที่ 4 เซลล์แมวดาวภายใต้กล้องจุลทรรศน์ชนิดหัวกลับ a) ที่กำลังขยาย 40 เท่า b) ที่กำลังขยาย 100 เท่า

แม้ในปัจจุบันสิ่งที่เราจะสามารถทำได้ดีกว่าการโคลนนิ่งคือ การช่วยกันอนุรักษ์สัตว์ป่า แต่อีกสิ่งที่เราจะสามารถทำควบคู่ไปกับการอนุรักษ์ได้ในขณะนี้ คือ การเก็บรักษาพันธุกรรม ซึ่งในที่นี้เป็นการเตรียมเซลล์ต้นแบบของสัตว์ป่าเก็บไว้ ถือเป็นการรักษาพันธุ์สัตว์ป่าโดยทางอ้อมและเป็นขั้นตอนเริ่มต้นในการสร้างสัตว์ชนิดนั้น ๆ ขึ้นมาได้ในอนาคตหากสัตว์ป่าชนิดนั้นมีจำนวนน้อยลงหรือสูญพันธุ์ไป


เอกสารอ้างอิง

รังสรรค์ พาลพ่าย, จันทร์เจ้า ล้อทองพานิชย์. แนวทางการโคลนนิ่งเพื่อการอนุรักษ์และเพิ่มจำนวนสัตว์ป่าใกล้สูญพันธุ์. วารสารสัตว์ป่าเมืองไทย 2547;10:82-5.

สารานุกรมไทยสำหรับเยาวชนฯ. เล่มที่ ๔๐ / เรื่องที่ ๕ การโคลนนิ่งสัตว์ [อินเทอร์เน็ต]. 2558 [เข้าถึงเมื่อ 8 สิงหาคม 2562] เข้าถึงได้จาก http://saranukromthai.or.th/sub/book/book.php?book=40&chap=5&page=chap5.htm.

ศูนย์นวัตกรรมเทคโนโลยีหลังการเก็บเกี่ยว. ไทยเยี่ยมโคลนนิ่งกระทิงป่าได้สำเร็จ [อินเทอร์เน็ต]. 2551 [เข้าถึงเมื่อ 8 สิงหาคม 2562] เข้าถึงได้จาก https://www.phtnet.org/news51/view-news.asp?nID=829.

ผู้เขียนบทความ

จารุภา เถาวัลย์

ศูนย์เฝ้าระวังและติดตามโรคจากสัตว์ป่า สัตว์ต่างถิ่นและสัตว์อพยพ
คณะสัตวแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล